CAR-NK：腫瘤免疫細(xì)胞療法“新星”冉冉升起
每個(gè)人的身體內(nèi)部都有一支隸屬于我們個(gè)人的專屬軍隊(duì)——免疫細(xì)胞，為保衛(wèi)我們的健康沖鋒陷陣，萬死不辭。NK細(xì)胞（Natural Killer Cell，中文名：自然殺傷細(xì)胞）是這支軍隊(duì)當(dāng)中非常重要的組成部分，它們是一群不同于T、B淋巴細(xì)胞的大顆粒淋巴細(xì)胞。
NK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，主要與殺死感染的微生物和惡性轉(zhuǎn)化的同種異體和自體細(xì)胞有關(guān)。NK細(xì)胞來源于CD34+共淋巴祖細(xì)胞。據(jù)估計(jì)，NK細(xì)胞的半衰期大約為7~10天，占人類外周血淋巴細(xì)胞總數(shù)的10-15%，也存在于脾臟、肝臟、肺、骨髓和淋巴結(jié)中，它們通過與DC細(xì)胞的相互作用發(fā)揮關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)功能。
NK細(xì)胞是第一組固有淋巴樣細(xì)胞的典型成員，具有分泌 IFN-γ 的能力。終末分化的 NK 細(xì)胞缺乏B淋巴細(xì)胞（CD19+）和 T 淋巴細(xì)胞（CD3+）的表型標(biāo)記，CD56是NK細(xì)胞特征的標(biāo)志。人外周血NK細(xì)胞可分為CD56bright和CD56dim兩大類。
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NK細(xì)胞療法概述
CAR-T 細(xì)胞療法發(fā)展迅速，但在臨床應(yīng)用中仍存在不足（諸如在實(shí)體瘤治療中的困擾；因患者疾病不同產(chǎn)生的差異性，有不同程度的神經(jīng)毒性和細(xì)胞因子風(fēng)暴）。這也是CAR-T 治療今后改進(jìn)的一個(gè)方向。
NK細(xì)胞，一個(gè)充滿潛力的候選療法。NK細(xì)胞來源非常廣泛，比如外周血、臍帶血、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）和NK細(xì)胞系。細(xì)胞因子風(fēng)暴（CRS）主要是由CAR-T細(xì)胞分泌的INF-γ、TGF-α、IL-1和IL-6因子等誘導(dǎo)的。然而，NK細(xì)胞分泌IL-3和GM-CSF，因此不太可能引起CRS。同時(shí)，由于腫瘤微環(huán)境中PD-1的表達(dá)，CAR-T細(xì)胞的功能受到抑制。NK細(xì)胞分泌PD-1的水平較低，免疫抑制作用較小。此外，NK細(xì)胞可促進(jìn)DC細(xì)胞遷移到腫瘤中，從而增強(qiáng)抗PD-1免疫治療。
NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定的殺傷效果，而且不受MHC識(shí)別的限制，是腫瘤免疫治療的潛在治療方式。異體NK細(xì)胞移植幾乎不會(huì)誘發(fā)移植物抗宿主?。℅VHD），不會(huì)導(dǎo)致CRS，可以作為完全“現(xiàn)貨型”產(chǎn)品使用。
以上這些優(yōu)點(diǎn)，使NK細(xì)胞成為抗實(shí)體瘤的理想候選細(xì)胞。
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CAR-NK細(xì)胞療法概述
CAR（嵌合抗原受體）技術(shù)是基因工程與免疫療法的完美融合，是當(dāng)前腫瘤治療領(lǐng)域具前景的研究方向之一。CAR-NK細(xì)胞，由識(shí)別腫瘤特異抗原的細(xì)胞外信號(hào)結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，它們可以建立新的激活途徑，以增強(qiáng)靶細(xì)胞的溶解。
CAR-NK細(xì)胞，不僅通過CAR特異性識(shí)別抗原表達(dá)腫瘤的能力，而且通過NK細(xì)胞受體自身來消除腫瘤。NK細(xì)胞的活性取決于是刺激和抑制信號(hào)的平衡，而不是抗原特異性。這些信號(hào)激活銜接蛋白，釋放穿孔素和顆粒酶，并控制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。NK細(xì)胞的另一種殺傷機(jī)制，涉及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。因此，CAR-NK細(xì)胞的靶向裂解基于CAR依賴和NK受體依賴機(jī)制，并且裂解也適用于抗原陰性膜的腫瘤。
在臨床前和臨床試驗(yàn)中，CAR-NK細(xì)胞療法當(dāng)之無愧成為細(xì)胞療法中的熱門選手。
CAR-NK細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用
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CAR-NK細(xì)胞的來源
目前，CAR-NK細(xì)胞主要來源包括外周血、臍血、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）和NK92細(xì)胞系。經(jīng)常使用的是捐贈(zèng)者外周血提取的NK細(xì)胞，但不同捐贈(zèng)者外周血擴(kuò)增的NK細(xì)胞可能存在差異。因此，對(duì)純化要求較高。
誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），是指將終末分化的體細(xì)胞通過導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子重編程為多能干細(xì)胞。iPSC的優(yōu)點(diǎn)較多，包括制備需少量供體細(xì)胞，可進(jìn)行無限培養(yǎng)，成本較低，可實(shí)現(xiàn)自體供給，免疫原性較低。
iPSC來源的NK細(xì)胞
目前iPSC目前主要處于科研階段，F(xiàn)ate Therapeutics 基于平臺(tái)量產(chǎn) iPSC-NK細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；慨a(chǎn)，且NK細(xì)胞可保持高度均一性。異體 iPSC可能存在致瘤性、免疫原性和異質(zhì)性問題。致瘤性主要源于iPSC無限增殖的特性，失控的細(xì)胞增殖可能導(dǎo)致腫瘤的形成；異質(zhì)性主要源于每個(gè)iPSC細(xì)胞系在分化和增殖中的差異。
圖：iPSC細(xì)胞制備流程
NK92細(xì)胞系
NK92細(xì)胞系，這種細(xì)胞系是從一位患有急性非霍奇金淋巴瘤的患者提取的細(xì)胞系。優(yōu)點(diǎn)是可無限增殖，對(duì)凍融敏感性較低，但NK92細(xì)胞不表達(dá)CD16受體，先天缺乏ADCC功能。由于來源于淋巴瘤細(xì)胞，給藥前需要輻射照射，讓其半衰期變短。因此，在臨床中需要多次給藥或全身給予IL-2維持NK細(xì)胞活性，這導(dǎo)致額外的風(fēng)險(xiǎn)。
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全球CAR-NK細(xì)胞療法的研究現(xiàn)狀
目前，全球CAR-NK細(xì)胞療法的開發(fā)正在如火如荼地開展中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從臨床階段的角度，絕大多數(shù)CAR-NK細(xì)胞療法正處于臨床Ⅰ期，占比約68%，處于Ⅱ期的項(xiàng)目約32%，尚無CAR-NK細(xì)胞療法進(jìn)入臨床Ⅲ期。
血液瘤中的臨床前研究
表1、CAR-NK細(xì)胞在血液瘤中的臨床前研究
實(shí)體瘤中的臨床前研究
表2、CAR-NK細(xì)胞在實(shí)體中的瘤臨床前研究
CAR-NK細(xì)胞的臨床研究
根據(jù)clinical.gov網(wǎng)站上的臨床數(shù)據(jù)，已有200多項(xiàng)關(guān)于CAR-T細(xì)胞的研究。然而，只有9項(xiàng)涉及CAR-NK細(xì)胞。
表3、CAR-NK細(xì)胞在血液瘤和實(shí)體瘤中的臨床研究
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CAR-NK細(xì)胞療法的挑戰(zhàn)和解決方案
CAR-NK細(xì)胞療法的改進(jìn)
迄今為止，CAR-NK細(xì)胞療法進(jìn)行了廣泛的臨床前研究。腫瘤異種移植（PDX）模型，是臨床腫瘤的經(jīng)典模型，因?yàn)樗苯訉⒛[瘤從患者轉(zhuǎn)移到NSG或NOG小鼠。大多數(shù)CAR-NK細(xì)胞療法在臨床前試驗(yàn)中已在PDX模型中進(jìn)行了療效評(píng)估，包括針對(duì)血液瘤靶點(diǎn)（諸如CD19、CD20、CD138和CS-1）和實(shí)體瘤（諸如HER2、GD2、PSCA和EGFRvIII）。與PDX相比，人源化小鼠更為精確。通過將造血干細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)以使其發(fā)育人類免疫系統(tǒng)，克服了PDX模型未能觀察到CAR-NK/T對(duì)腫瘤微環(huán)境中宿主免疫細(xì)胞的影響的失敗。
臨床應(yīng)用挑戰(zhàn)和解決方案
CAR-NK細(xì)胞療法具有巨大的潛力，如果要擴(kuò)大其臨床應(yīng)用，必須要解決一些基本問題。
首先，NK細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增是第一道障礙。單個(gè)供體的NK細(xì)胞數(shù)量太少，不足以進(jìn)行治療，這使得NK細(xì)胞的擴(kuò)增和激活變得非常關(guān)鍵。通常需要2-3周時(shí)間來培養(yǎng)NK細(xì)胞。供體細(xì)胞數(shù)量的可用性仍然是一個(gè)障礙。此外，必須完全清除里面混雜的T細(xì)胞，以防止GVHD。因此，如何獲得足夠的NK細(xì)胞仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。從iPSC里獲得大量的NK細(xì)胞是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。
第二，選擇合適CAR很關(guān)鍵。目前大多數(shù)的CARs是為構(gòu)建CAR-T細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。因此，對(duì)于NK細(xì)胞來說并不是佳選擇。CAR結(jié)合表位的位置及其與CAR-NK細(xì)胞表面的距離影響其結(jié)合抗原和激活CAR-NK細(xì)胞的能力。
第三，如何將CAR轉(zhuǎn)到NK細(xì)胞，這是CAR-NK細(xì)胞免疫治療的關(guān)鍵。到目前為止，病毒載體和非病毒載體都被用來轉(zhuǎn)化CAR。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)染效率很高，但可能會(huì)引起插入突變、致癌和其他不良反應(yīng)。慢病毒載體插入突變發(fā)生率較低，但轉(zhuǎn)染效率低（約20%）。睡美人系統(tǒng)已應(yīng)用于CAR-T。對(duì)CAR-NK結(jié)構(gòu)的是否適用尚不清楚。mRNA轉(zhuǎn)染也被認(rèn)為是一種安全、實(shí)用的轉(zhuǎn)染方法。
后，NK細(xì)胞對(duì)凍融過程敏感。解凍后NK細(xì)胞的存活率和細(xì)胞毒性顯著降低。如果加入IL-2，則可以部分恢復(fù)冷凍NK細(xì)胞的活性。為了使細(xì)胞冷凍保存成為可行的佳策略，必須對(duì)冷凍NK細(xì)胞進(jìn)行探索。
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如何提高CAR-NK的安全性和有效性
CAR-NK細(xì)胞療法的安全性
將自殺基因整合到CARs中，可以提高CAR-NK細(xì)胞治療的安全性。HSV-TK/GCV自殺系統(tǒng)，在20世紀(jì)90年代首次用于造血干細(xì)胞移植。凋亡途徑（如Fas和caspase9），也已經(jīng)被用作自殺系統(tǒng)。
自殺基因
CAR由阻斷抗原結(jié)合位點(diǎn)的掩蔽肽和蛋白酶結(jié)合點(diǎn)組成。當(dāng)?shù)鞍酌笍哪[瘤微環(huán)境（TME）中的掩蔽肽分離時(shí)，CAR-T細(xì)胞可以在腫瘤局部保持活性。將HIF1的氧敏感域與CAR結(jié)構(gòu)融合，設(shè)計(jì)了氧敏感CAR。此外，CAR-T被設(shè)計(jì)成當(dāng)synNotch和CAR配體在腫瘤上共同表達(dá)時(shí)激活，這是一種在空間上識(shí)別并有效控制CAR-T細(xì)胞激活的策略。
CAR-NK細(xì)胞療法的有效性
設(shè)計(jì)CAR-NK細(xì)胞，沉默NK抑制受體可使其對(duì)腫瘤有更強(qiáng)的抵抗力。當(dāng)IL-4和IL-7受體結(jié)構(gòu)域與反向細(xì)胞因子受體（4/7 ICR）融合，并添加到CAR中時(shí)，發(fā)現(xiàn)來源于腫瘤的IL-4抑制作用降低從而，促進(jìn)了CAR-T細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)染CAR/ICR的T細(xì)胞，在體內(nèi)對(duì)含IL-4的TME具有持續(xù)的抗腫瘤作用?？紤]到CAR-NK細(xì)胞的特異性，ICR受體（IL-15，IL-21）是否適用于CAR-NK細(xì)胞，尚需研究。
有趣的是，以4-1BB作為共刺激分子的CAR-T細(xì)胞依賴于氧化代謝，可增強(qiáng)線粒體活性、促進(jìn)T細(xì)胞增殖和維持T細(xì)胞持久性，并增強(qiáng)抗PD-1活性。因此，可以嘗試通過調(diào)節(jié)CAR-NK細(xì)胞的代謝來提高療效。
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文末小結(jié)
NK 細(xì)胞具有獨(dú)特的抗腫瘤效應(yīng)，不受MHC限制的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色。
CAR-NK 細(xì)胞療法是一個(gè)很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對(duì)某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。相信，CAR-NK細(xì)胞療法可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤免疫治療的革命性進(jìn)展。
參考資料：
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